Свечение сопровождающее биологические реакции
нтного железа. Амплитуда сигнала
хемилюминесценции хорошо коррелировала с количеством продуктов перекисного
окисления липидов, определяемых химическим методом, и зависела от липидного
состава плазмы крови и концентрации в ней антиоксидантов, то есть веществ,
тормозящих процессы, идущие с участием
свободных радикалов. Во многих случаях данные таких анализов были признаны
ценными в качестве дополнительных при постановке врачом диагноза
заболевания, контроля за эффективностью лечения и прогноза течения болезни.
Все же измерение неактивированной хемилюминесценции в широкую клиническую
практику пока не вошло в отличие от хемилюминесценции в присутствии
активаторов.
В присутствии определенных соединений, обычно называемых в
отечественной литературе "активаторами", свечение клеток и тканей может
быть усилено на несколько порядков величины. Наибольшее распространение
получило измерение хемилюминесценции, связанной с выделением клетками
активных форм кислорода (к которым относятся супероксид, гидроксильный
радикал, перекись водорода и гипохлорит): хемилюминесценция наблюдается в
присутствии активаторов люминола и люцигенина. Активированная
хемилюминесценция довольно широко применяется в клиническом биохимическом
анализе.
Активированная хемилюминесценция
Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в
клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не
случайно получила название "сверхслабого свечения" . Это оказалось главным
и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию
собственной хемилюминесценции в аналитических целях.
Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции
в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной
литературе общее название "активаторов", а за рубежом - "усилителей"
(enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются
на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать
химическими и физическими активаторами .
Химические активаторы ХЛ - это соединения, вступающие в реакции с
активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе
которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии.
Наблюдаемое при этом hemilum связано с переходом молекул в основное
состояние., что приводит к высвечиванию фотонов:
Активатор + радикалы > продукт* > продукт + фотон
Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить
люминол (3-аминофталевый гидразид, см. Рис. 4) и люцигенин [Бис(N-
метилакридиний)] Физические активаторы не вступают в химические реакции и
не влияют на ход реакций, сопровождающихся hemilumм, но тем не менее
многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия
лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы
продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:
Радикалы > продукт* > продукт + фотон 1 (неактивированная ХЛ)
Продукт* + активатор > продукт + активатор* > фотон 2 (активированная ХЛ)
Хемилюминесцентный иммунный анализ
По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от
радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченных
субстратов или антител используются субстраты и антитела,"меченные"
соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся
хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно
это фермент пероксидаза).
Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат
низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и
люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры
акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится
либо к антигену, т. е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на
этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno
Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По русски это
соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-
ХемилюминоМетрический Анализ).
Оба метода направлены на определение биологически-важных
низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как
правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах.
При использовании метода CIA к раствору, содержащему интересующее нас
анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное
количество того-же, но ХЛ-меченного соединения (обозначим его как A*) и
антитела (анти-A). Образуется смесь меченных и немеченных иммунных
комплексов (A-анти-A и A*-анти-A, соответственно):
A + A* + анти-A > A-анти-A + A*-анти-A.
Очень важно, что пропорция между меченным и немеченым иммунными
комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и
сколько немеченого было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было
немеченого антигена, тем меньше доля меченных антител.
Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить
количество A*-анти-A по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем
меньше, чем больше было немеченых антигена A (т. е. анализируемого
вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным,
предварительно строят калибровочную кривую, т. е. измеряют зависимость
интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора
изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с
неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по
калибровочной кривой находят концентрацию A.
При использовании метода ICMA берут избыток ХЛ-меченного антитела (анти-
A*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-
меченный иммунный комплекс:
A + анти-A* > A-анти-A*
Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и
измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем больше
было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь
предварительно строят калибровочную кривую.
В обоих методах одна из практических трудностей - это очистка иммунных
комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы
здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в
использовании порошка сорбента (см. Рис. 6 В), к поверхности которого
"пришиты" (т. е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к
анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-
анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-
А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и
затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество
меченного антигена.
Биолюминесценция
Биолюминесценция - (БЛ) - это hemilum живых организмов, видимое простым
глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным
систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм
реакций, сопровождающихся hemilumм, весьма различен у разных видов; однако
обычно включает в себя химическое превращение определенного
низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое
ферментом, называемым люциферазой.
С развитием техники измерения очень слабых световых потоков стало
ясно, что свечение при химических реакциях (хемилюминесценция) - не такая
уж экзотика. Слабое свечение сопровождает по существу все химические
реакции, идущие с участием свободных радикалов. Собственное свечение
животных клеток и тканей обусловлено преимущественно реакциями цепного
окисления липидов и реакциями, сопровождающими взаимодействие окиси азота и
супероксидного радикала.
Известное с древних времен видимое простым глазом свечение некоторых
организмов, например светляка, которое называют биолюминесценцией, также
нашло широкое применение в клинических анализах и медико-биологических
научных исследованиях.
Биолюминесценция светляка
Всем известное hemilum светлячков происходит в результате биохимической
реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии
аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):
|E + LH2 + ATP > E-LH2-AMP + PP |
|E-LH2-AMP P*-E-AMP > E + P + AMP + фотон |
Здесь AMP - аденозинмонофосфат, PP - пирофосфат, E - люцифераза, LH2 -
люциферин, P* и P - продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и
основном состояниях, соответственно.
В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один
из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для
определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе,
к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из
светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии.
Удается определять содержание АТФ в образце от 10-17 моля и выше.
Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности
клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения
бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности
эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы
ант
| |  скачать работу |
Свечение сопровождающее биологические реакции |
