Изоферменттерді гистохимиялық бояу

Изоферменттерді гельде электрофорез арқылы бөлгеннен кейін оларды гистохимиялық әдістермен айқындайды. Қазіргі кезде изоферменттерді бояудың көптеген әдістері бар. Олардың барлығының негізі: ферменттердің субстратпен байланысу нәтижесінде түзілген қосылыс бояғышпен ерімейтін комплекс түзіледі, ол гельде бойалған жолақтар түрінде көрінеді. Ол өз кезегінде изоферменттердің гельдегі орналасуын анықтауға мүмкіндік береді:

1)                   Эстераза, негіздік және қышқылдық фосфатазаны анықтау. Бұр реакцияда субстрат қызметін α- және β-нафтилацетат, нафтилпропионат,  нафтилфосфат атқарады. Ферменттердің субстратты катализдеу нәтижесінде бос нафтол бөлініп шығады. Бояғыш ретінде тетрадиазотталған 0-дианизиндин, гексоазотталған негіздік фуксин және басқа да диазотталған, тұрақты ароматты аминдер қолданылады. Бұл бояғыштар нафтолмен коңыр түсті боялған қосылыстар түзеді. Нәтижесінде гельдегі фермент орналасқан жер қоңыр түске боялады. Эстераза үшін көп таралған бояғыш Fast blue RR, Fast blue B және т.б.

2)                Каталазаны анықтау. Каталазаны анықтау үшін гельге электрофорез жүргізбес бұрын крахмал қосады (ол изоферменттердің бөлінуіне және полиакриламидтің полимерленуіне кедергі жасамайды). Электрофорезді кейін гельде бірнеше минут сутек асқын тотығы (Н₂О₂) ерітіндісінде ұстайды, одан кейін оған KI ерітіндісін қосады. Ол кезде Н₂О₂ KI-пен әрекеттеседі, ол бос I₂ –нің бөлінуіне әкеліп соғады. Ол бөлінген I₂ крахмалды көк түске бояйды. Ферменттердің орналасқан жерінде ақ түс пайда болады.

3)                Дегидрогеназаларды анықтау әдістері. Олардың гистохимиялық боялуы бірнеше сатыда жүреді. НАД- және НАДФ-спецификалық дегидрогеназаларға (алкогольдегидрогеназа, малатдегидрогеназа, глутаматдегидрогеназа) арналған инкубациялық орта компоненттің құрамы бойынша бірдей, тек субстрат бойынша ғана айырмашылығы болады. Субстрат ретінде органикалық қышқылдар (глуатмин, алма қышқылы, сүр қышқылы және т.б) және олардың тұздары, спирт т.б қосылады. Бояғыш ретінде нитрокөк тетразол пайдаланады. Олар тотықсызданған НАДФ-пен күлгін (фиолетті) косылыс түзеді.

Әдебиеттерде 60-тан астам ферменттерді бояудың 90-ға жуық әдісі жазылған.Төменде зерттеулерде пайдаланған ферменттерді бояу әдістері көрсетілген. 

Пайдаланған әдебиеттер:

1. К. Райдер, Т. Тейлор Изоферменты М: Мир 1983г. С 19-35
2. Уоэбб, Диксон 3 том. Ферменты.
3. Биохимия. Сейтов
4. Серебровский А. А. Генетический анализ //М.: Наука. 1970  С.337
5. К. Н. Сарсенбаев, А. А-Х. Беков, И. Р. Рахимбаев. Изоферменты в хемосистематике высшых растений. Из-во «Наука» КазССР, Алматы 1982г, С. 99-113.
6. Е. В. Левитес Генетика изоферментов рестений Новосибирск: Наука 1986г.
7. С.И. Абугалиева. Молекулярные маркеры в изучении генетической разнообразия сидов  AEGILOPS и TRITICUM, изоферменты // Биотехнология. Теория и практика, № 1-2, 2001г.
8. Интернет материалдарынан — Google

скачать работу

Отправка СМС бесплатно