Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
но в
случае раковой опухоли.
Благодаря использованию в исследованиях сканирующих и проточных
цитофотометров определены важные данные, касающиеся классификации
клеток по фазам митотического цикла, а также получены результаты,
позволяющие оценить продолжительность и дисперсию соответствующих
фаз цикла G1, S, G2+M.
Однопараметрический анализ кинетики клеточного цикла по изучению
содержания ДНК показал возможности количественной цитометрии и
открыл широкие перспективы относительно его использования для
исследования и углубления знаний по изучаемому вопросу.
В настоящее время появились данные, которые значительно
расширяют традиционное представление, касающееся распределения
клеток в четырех последовательных фазах цикла. Одновременное
изучение двух параметров – ДНК и белка, ДНК и РНК – дает
существенно больше информации о кинетике клеточного цикла, так как
позволяет разделить сливающиеся фазы цикла, такие, как G0+ G1,
G2+M, а также идентифицировать дополнительные фазы в
пресинтетическом (G1) и постсинтетическом (G2) периодах. При
анализе пресинтетического периода в эксперименте и клиническом
материале была показана возможность использования АО (ДНК и РНК)
для дополнительной классификации G1-периода на GIQ, GIA, GIB и G2A,
G2B (Z.Darzynkiewicz, F.Traganos, M.R. Melamed, 1980).
На культуре клеток Hela с использованием меченых радиоактивных
изотопов и проточной цитометрии выделены в постсинтетическом
периоде клетки, относящиеся к ранней (G2A) и поздней (G2B) фазам
клеточного цикла (O.C.Blair, R.T.Winward, J.L.Roti, 1979).
Pollack и др. (A.Pollac, H.Moulis, N.L.Block, G.L.Irvin, 1984)
при цитометрическом анализе ДНК и белка (FITC/PI) в клетках трех
различных экспериментальных моделей, включающих культуру лейкозных
опухолевых клеток крыс FL4, микрокультуру лимфоцитов периферической
крови человека HPBL, не стимулированных и стимулированных
фитогемагглютинином (ФГА), а также материала солидной опухоли в
виде перевивной аденокарциномы предстательной железы крыс R 3327=Q
показал возможность разделения пресинтетического периода на три
фазы, выделив в нем покоящиеся клетки GIQ, ранние GIA и поздние
G2B клетки, в постсинтетическом периоде были соответственно
выделены ранние G2А и поздние G2B клетки. Для задержки вхождения
клеток в S-фазу использовали актиномицидин D, оксимочевину, для
блока митотических клеток применяли колцемид.
В работе также представлены данные, свидетельствующие о
возможности классификации пролиферирующих лимфоидных и лейкозных
опухолевых EL4-клеток в различные сроки культивирования на
соответствующие S-фазы клеточного цикла с раздельным выделением в
них M- и G2-фаз. Исходя из представленных данных, очевидно, что
проточный цитометрический анализ по двум параметрам является одним
из перспективных методов оценки кинетики клеточного цикла,
позволяющий провести идентификацию клеток, находящихся в ранее
неопределяемых фазах цикла (G1A, G1B и G2A, G2B), и определить
клетки, находящиеся в фазах M и G2.
В некоторых работах клинического направления используется
двухпараметрический анализ клеточного материала с достаточно
успешной классификацией патологических процессов, например при
распознавании доброкачественных и раковых процессов мочевого
пузыря, шейки матки, а также для классификации различных форм
гемобластозов.
В современной литературе весьма широко представлены данные по
цитоспектрофотометрическому изучению интерфазных ядер. Следует
отметить, что особую ценность представляют работы, направленные на
изучение митотических клеток с последующим анализом хромосом.
Известно, что изменения, регистрируемые в хромосомах, могут быть
определяющими диагностическими маркерами опухоли, особенно на
начальных этапах возникновения злокачественного процесса. Однако
используемые методы анализа хромосомного материала сравнительно
сложны и трудоемки. Поэтому в последнее время наряду с обычными
цитогенетическими методами исследования кариотипа нормальных и
малигнизированных клеток стали применяться сканирующие и проточные
цитометрические анализаторы. Приборы последнего типа обеспечивают
достаточно высокую точность и скорость измерения, а также
воспроизводимость результатов. Скорость анализа хромосом в протоке
составляет 1000 – 2000 хромосом в секунду. Проточный
цитометрический анализ ДНК метафазных хромосом в суспензии является
совершенно новым методом кариотипирования. Поэтому в исследованиях
такого рода основной акцент делается на разработке эффективных
методов сепарации интактных хромосом с сохранением их целостности и
морфологической структуры.
В представленных работах чаще всего изучаемой моделью являются
метафазные хромосомы, полученные из клеток китайского хомячка и
человека, приготовленные для прямого кариотипирования, а также для
анализа кариотипа с кратковременным или длительным культивированием
клеток. Для анализа генетического материала используются
однопараметрические проточные системы, где проводится анализ и
сортировка хромосом по интенсивности флуоресценции в комплексе с
такими флуорохромами, как PI, EtBr, Ho 33258, а также применяются
высокоразрешающие проточные цитометры с двухлазерной системой,
которые обеспечивают бивариантный анализ ДНК, меченный двумя
флуорохромами. Большей частью используют сочетание Но 33258,
специфически связывающийся с АТ-богатыми участками ДНК, и
хромомицин А3, селективно взаимодействующий с ГЦ-парами.
Данные, полученные при помощи автоматизированных систем,
представляются в виде гистограмм, так называемых проточных
кариограмм. О качестве анализа свидетельствует высокое разрешение
гистограмм, Которые характеризуются множественными узкими пиками,
относящимися к различным классам хромосом. Количество пиков в
большинстве случаев соответствует набору хромосом, которое
характерно для данного индивидуума. При исследовании клеток
зародыша китайского хомячка методом проточного кариотипирования на
этапе экспоненциального роста были получены все 11 пиков,
соответствующие 11 парам хромосом самки, исследуемого животного
(J.A.Steinkamp, 1984).
Обычно применяемые цитогенетические методы не позволяют
идентифицировать Y-хромосому из G- и F-групп хромосом человека.
Применение проточной цитометрии позволяет решить эту задачу. Так,
на лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров-мужчин, с
кратковременным культивированием (52 ч) и добавлентем колцемида
была показана возможность определения позиции Y-хромосомы по
интенсивности ДНК-флуоресценции (Но 33258) в виде пика на проточной
кариограмме. У 17 обследуемых доноров позиция Y-хромосомы на
гистограмме варьировала. В некоторых наблюдениях пик Y-хромосомы
находился между 19 и 20 хромосомами, в других – между 20-й и 17-й.
В 70% случаев Y-хромосома была контаминирована с 20-й.
Из работ, посвященных хромосомному анализу, известно, что при
использовании однолазерной проточной системы может быть
идентифицировано около 15 хромосом человека, исключая Y-хромосому.
Применение двухлазерной системы (FACS-11) позволяет по
интенсивности флуоресценции распознать около 20 популяций хромосом
в метафазных пластинках и, что особенно ценно, идентифицировать
маленькие аутосомы человека (M.Lalande, R.R.Schreck, R.Hoffman,
S.A. Latt, 1985). В этом случае помимо флюорохромов Но 33258 и
хромомицина А3 в комплекс субстрат-флюорохром вводится третий
краситель: нетропсин или дистамицин А. Это способствует получению
дополнительной информации о специфике хромосом, т.е. определению
структурных особенностей нормальных и атипических хромосом. В
результате бивариантного проточного анализа с дополнительной
окраской хромосом авторам удалось на модели клеточной линии
человеческих лимфобластов получить высокое разрешение метафазных
пластин с последующим изучением структурной перестройки хромосом и
идентификацией аномальных.
Проточный бивариантный анализ, используемый для кариотипа
хромосом, апробирован на достаточно широком спектре клинического и
экспериментального материала, включая опухоль прямой кишки,
культуры клеток асцитической жидкости, лимфоцитов периферической
крови и фибробластов человека (V.G.Enchev, K.G.Tsanev, 1985).
4.Наиболее употребительные методики, используемые в цитометрии
клеточного цикла.
При проточной цитометрии можно сканировать от 100 до нескольких
тысяч клеток в секунду, что позволяет очень быстро получить
достоверные результаты. Однако таким способом можно анализировать
только очень разбавленные клеточные суспензии. Солидные ткани
необходимо сначала дезагрегировать, что всегда сопровождается
нарушением морфологии. Клетки монослоя обычно диспергируют
обработкой трипсином в присутсвии ЭДТА.
Дезагрегация свежих солидных опухолей
Методы дезагрегации клеток можно подразделить на три группы:
- методы, основанные исключительно на механической обработке;
- ферментативные методы;
- методы выделения ядер
Самые простые и быстрые методы дезагрегации включают только
механическую обработку тканей. Эти методы особенно хороши для
рыхлых тканей (например, лимфатических узлов) и позволяет получать
густые суспензии клеток за несколько минут. Для получения
неочищенных клеточных суспензий можно использовать аспираты
солидных опухолей, взятые с помощью шприца.
Ферментативный метод позволяет получить достаточно
концентрированную клеточную
| |  скачать работу |
Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии |
