Исследование клеточного цикла методом проточной цитометрии
Другие рефераты
ВВЕДЕНИЕ
Возможности применения методов количественной цитометрии в
биологических и медицинских исследованиях очень широки. Они
включают множество задач, начиная от поиска наиболее информативных
морфометрических и цитоспектрофотометрических критериев кинетики
ДНК в клеточном цикле и кончая многопараметрическим изучением
гетерогенных популяций исследуемых объектов. Хотя эти задачи могут
решаться на различных экспериментальных моделях или клиническом
материале, общие принципы остаются одинаковыми как для тех, так и
других объектов.
В настоящее время цитометрию принято подразделять на
проточную и статическую. Первый вариант цитометрии осуществляется с
помощью специальных приборов – проточных цитометров и сортеров. Для
статической цитометрии могут быть использованы конфокальные
микроскопы, а также более простые и дешевые системы анализа
изображений, смонтированные на обычных люминесцентных микроскопах.
Существует много методик, которые с одинаковым успехом можно
воспроизводить как с помощью проточной, так и статической
цитометрии. Более того, статическая цитометрия в некоторых случаях
позволяет получить более обширную информацию о клетках, причем ее
производительность не намного меньше проточной.
Настоящий обзор литературы посвящен применению цитометрии для
оценки параметров клеточного цикла на экспериментальном и
клиническом материале. Хотя в обзоре в основном приводятся
сведения, касающиеся проточной цитометрии, с учетом изложенного
выше они в значительной степени распространяются также и на
статическую цитометрию.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.Общие принципы проточной цитометрии
Метод проточной цитометрии сформировался за последние 30 лет на
основе отдельных опытов по подсчету числа частиц и определению их
размеров. В 1965 г. появилось первое сообщение о клеточном сортере,
а в 70-х годах стали выпускать приборы, способные измерять
интенсивность флуоресценции при двух и более длинах волн и
определять сразу несколько клеточных параметров.
В настоящее время выпускают два основных типа приборов для
проточной цитометрии: 1) простые в использовании аппараты, которые
могут измерять флуоресценцию при двух и более длинах волн и
светорассеяние под углом около 10є (малоугловое прямое рассеяние) и
90є; 2) большие клеточные сортеры, которые не только измеряют пять
и более клеточных или ядерных параметров, но и сортируют частицы с
заданным набором этих параметров.
Принципы проточной цитометрии весьма просты. Клетки или ядра
поодиночке пересекают сфокусированный световой пучок, обычно
лазерный. Свет определенной длины возбуждает молекулы
флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными
компонентами, при этом при этом может происходить одновременное
возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценить
сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый
красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и разлагают
на компоненты. Световые сигналы детектируют, преобразуют в
электрические импульсы и далее в форму, удобную для компьютерной
обработки и хранения информации.
Методом проточной цитометрии можно получать самые разные данные:
определять содержание в клетке ДНК и РНК, суммарное количество
белков и количество специфических белков, узнаваемых
моноклональными антителами, исследовать клеточный метаболизм
(например, измерять внутриклеточный рН), изучать транспорт ионов
кальция и кинетику ферментативных реакций (M.G.Ormerod, 1990).
В продаже имеются разные проточные цитометры, и изложить общие
принципы их работы сложно. Можно отметить лишь несколько моментов,
общих для всех приборов:
- для анализа необходимы гомогенные суспензии изолированных клеток;
- клетки или ядра должны иметься в достаточном количестве;
- для устранения эффектов, связанных с возможной агрегацией клеток,
необходимо использовать всю доступную информацию, например данные
по рассеянию света в объеме и отношение площади пика к его
ширине.
2. Анализ ДНК-гистограмм
Измерение содержания ДНК – одно из самых простых и
распространенных применений проточной цитометрии. Первые ДНК-
гистограммы, полученные в 1969 г.(M.A.Van Dilla, T.T. Trujillo,
P.F.Mullaney, J.R.Coulter, 1969), позволили четко различить клетки,
находящиеся в G1-, S- и G2/М-фазах клеточного цикла. С тех пор
появилось множество работ по измерению содержания ДНК в клиническом
материале, полученном в основном от больных раком.
Из ДНК-гистограмм можно получить два рода данных. Во-первых,
идентифицировать клетки с аномальным содержанием ДНК (рис.1, Б),
так называемые анеуплоидные клетки. Во-вторых, определить долю
клеток, находящихся в S-фазе (SPF), и оценить степень пролиферации.
Как правило, в клеточной популяции с высокой пролиферативной
активностью число клеток в S-фазе больше, чем обычно.
Международный комитет по аналитической цитометрии (W.Hoddeman,
J.Schumann, M.Andreeff, B.Barlogie, C.J.Herman, R.C.Lief et.al,
1984) попытался стандартизировать множество способов анализа ДНК-
гистограмм, и тем не менее для анализа продолжают использовать
различные подходы, часто с привлечением компьютерных прграмм. Далее
будут рассмотрены некоторые из этих подходов :
Вычисление коэффициента вариации (CV)
Самый простой способ оценки качества результатов основан на
вычислении CV для G1-пика ДНК диплоидных клеток. Эта величина
определяется из приведенного ниже соотношения в предположении, что
G1-пик следует нормальному распределению:
CV = W / (M · 2,35),
Где W – ширина пика на уровне полувысоты, М – номер канала для
максимума G1- пика.
Чем меньше CV и чем лучше G1-пик отвечает нормальному
распределению, тем качественнее результаты. В действительности
качество ДНК-гистограмм, как правило, не очень высоко, и чтобы
судить о достоверности результатов, полученных при клинических
исследованиях, приходится оценивать средний CV и диапазон его
значений.
Вычисление индекса ДНК
Индекс ДНК для «анеуплоидного» пика (пиков) на гистограммах с
двумя или более G1-пиками (рис.1, Б) вычисляют, ориентируясь на
«диплоидный» G1-пик. Так, на рис. 1, Б G1-пику для опухолевых
клеток соответствует вдвое большее количество ДНК, чем G1-пику
диплоидных клеток, поэтому индекс ДНК для него равен 2,0. Для
анеуплоидных клеток, содержащих на 50% больше ДНК, чем нормальные,
индекс равен 1,5. Анеуплоидию можно выявить только в тех случаях,
когда на гистограммах имеется не менее двух G1-пиков. Чтобы
установить, какой из близко расположенных друг к другу G1-пиков
соответствует диплоидным клеткам из свежих образцов ткани, можно
использовать внешний ДНК-стандарт. Если присутствуют только
диплоидные клетки, то ИД считают равным 1,0.
Основная проблема при определении плоидности связана с
трудностью выявления малого числа анеуплоидных стволовых клеток.
Еще труднее идентифицировать малочисленные тетраплоидные стволовые
клетки, поскольку такие клетки в G1-фазе по содержанию ДНК
равноценны диплоидным клеткам в фазе G2. Так, в отличие от рис 1,
Б, на котором четко виден высокий «тетраплоидный» пик, на рис.1, А
обнаруживается лишь слабый пик, соответствующий четырем гаплоидным
наборам ДНК.
Определение доли клеток, находящихся в S-фазе
Для определения доли клеток в S-фазе используется метод Байсха и
др.(H.Baisch, W.Gohde, W.A.Linden, 1975), модифицированный
применительно к анеуплоидным клеткам. Суть метода состоит в
построении прямоугольника, вписывающегося в пространство между G1-
и G2-пиками. Высота этого прямоугольника определяется числом
клеток, приходящихся на 10 центральных каналов области S-фазы, из
которого вычисляется среднее число клеток на канал. Аналогичным
способом можно определить долю анеуплоидных клеток в S-фазе при
условии, что высоту прямоугольника (рис.1, Б) можно вычислить,
используя ту часть гистограммы, которая не перекрывается с
областью, отвечающей диплоидным клеткам.
3. Анализ параметров клеточного цикла
Благодаря фундаментальным исследованиям в области
экспериментальной биологии и клинической медицины были получены
факты, касающиеся кинетики клеточного цикла.
К настоящему времени уже накоплен определенный опыт
работы по данному вопросу. Практически не существует ни одного
органа или ткани человеческого организма, экспериментального
животного, который бы не подвергался цитометрическому или
цитоспектрофотометрическому анализу. На основании этих данных
установлено, что содержание ДНК нормальных соматических клеток
соответствует диплоидному набору хромосом (2с) и характеризуется
одним модальным классом на ДНК-гистограмме. Значение этого
параметра для одного и того же индивида может колебаться в пределах
30%. Наиболее выраженные вариации в содержании ДНК наблюдаются в
клетках пролиферирующих органов – печени и селезенки. Эти данные
были получены при определении содержания ДНК в ядрах клеток
различных органов и тканей фенотически здоровых людей (130 проб –
по 5 – 14 от каждого случая)(E.Muller, R.Weidhase, 1983).
В изучаемых объектах схематически представлены фазы
митотического цикла и распределение ДНК в различных тканях.
Рассчитывалась кинетика клеточной пролиферации, а в патологически
измененном органе – степень выраженности процесса, особен
| |  скачать работу |
Другие рефераты
|
