Главная    Почта    Новости    Каталог    Одноклассники    Погода    Работа    Игры     Рефераты     Карты
  
по Казнету new!
по каталогу
в рефератах

Методы разделения иммуноглобулинов

gG,   а  позже  -на  IgА
(Петров , 1987).
    IgM  в  основном  имеет    внутрисосудистую    локализацию,    небольшое
количество  его обнаружено в тканевых жидкостях,  но в слизистых  выделениях
он обычно отсутствует  (Jonas,  1972).  У большинства же   животных   (кроме
кроликов) IgM через плаценту проходить не может ( Маслянко , 1973).
    в) Иммуноглобулины класса А.  IgA впервые  идентифицирован  в  сыворотке
крови человека иммуноэлектрофорезом как (2А-глобулин (Burtin  et  al,  1957,
Грабар, Буртэн, 1963).
    Иммуноглобулин  А-  один   из   наименее   изученных   защитных   белков
человека и животных. Это объясняется исключительно низким его содержанием  в
нормальной сыворотке  крови,   трудностями  выделения,  а  также   некоторым
сходством    с   иммуноглобулинами    класса    6    и    другими    белками
неиммуноглобулиновой природы.
    Существуют компоненты  IgА с  константами  седиментации  7S,  11S,  13S,
15S5,  17S.  В полимерных  формах   иммуноглобулина  А  (рис.  3)  обнаружен
дополнительный полипептид J цепь (Halpern, Koshland, 1970).

                        Рис.3 Строение  молекулы  IgA
        (из  книги Р. В. Петрова "Иммунология". -М.: Медицина, 1987).
  SС- секреторный   компонент;   j-  соединяющая; H-тяжелые; L-легкие цепи

    В нормальной человеческой сыворотке найдены два антигенно  различающихся
подкласса IgA - А1  и  А2  (Vaerman,  Hereman,  1966,  Kunkel,  Prentergast,
1966, Feinstein, Franklin, 1966, Fomasi, Yrey,  1972).   IgA2  существует  в
виде димеров, соединенных дисульфидной  связью,  а  тяжелые  и  легкие  цепи
связаны нековалентными связями (Yrey  et  al,   1968,   Незлин,  1982).  Оба
подкласса IgA  обладают  активностью  антител  (Dorrington,  Fanford,  1970,
Бернет, 1971). Молекулы IgА, содержащиеся в  различных  секретах  -  молоке,
молозиве,  пищеварительных  соках,  слюне,  моче  и  т.д.,  имеют  константу
седиментации  11S  и   содержат    дополнительную   полипептидную   цепочку-
секреторный  компонент  с молекулярной массой 50 000 -  60  000  (Brandt  et
al, 1968, 1975, Fomasi et al, 1965, 1968).
    Иммуноглобулины А слюны и пищеварительного тракта устойчивы  к  действию
протеолитических ферментов - пепсина и  трипсина  (Ballierex  et  al,  1969,
Porter,  Noakes,  1970).   Эта   резистентность   связана   с   присутствием
секреторного компонента синтезированного в выделяющей секрет железе и  затем
 присоединенного к молекуле IgA с образованием димеров из двух  его  молекул
(Стефани, 1973, Чернохвостова, 1974, Першин, 1980).
    Поэтому в секретах IgA обычно находится  в  виде  димеров  или  тримеров
Гаврилова , 1976). Мономеры IgА имеют молекулярную  массу  160  000.  IgА  у
некоторых   видов   животных   имеет   более   высокую   электрофоретическую
подвижность, чем  IgМ.  Содержание  углеводов  высокое  -10%.   Молекулярная
масса в основном, одинакова с IgG1, а у некоторой  части  популяции  молекул
IgA она промежуточная между IgA и IgM.  Как  и  у  других  иммуноглобулинов,
восстановление приводит к  распаду  молекулы  на  тяжелые   и  легкие  цепи.
Характерны тяжелые цепи.
    IgA в  сыворотке  крови  человека  содержится  в   относительно  большем
количестве,   чем  IgМ  и  составляет  около  19%   от   общего   количества
иммуноглобулинов  (Hobby,   1971).   В   сыворотке   крови   многих    видов
животных,  в частности овец и крупного рогатого скота,  IgM преобладает  над
IgA.  Значительное  количество  этого  белка  обнаружено   в   лимфе,    где
концентрация его в 2-18 раз выше, чем  в  крови  (Стефани,  1971).  Антитела
найдены и в содержимом  кишечника  и фекалиях,  80%  которых  приходится  на
долю IgА. Антитела, выделяющиеся в кишечник в устойчивой к гидролизу  форме,
 играют  важную роль в защите организма от кишечных инфекций  (Fomsi,  Yrey,
1972). IgА находится на поверхности слизистых оболочек и  активно  участвует
в местной иммунологической защите (Герберт, 1974).
    г) Иммуноглобулины класса D. IgD также изучен недостаточно.  Впервые  он
охарактеризован  как  четвертый  класс  иммуноглобулинов   D.Rowe,   G.Fahey
(1965). Его молекулярная масса около 180000. Молекула IgD  состоит  из  двух
легких  и  двух  тяжелых  полипептидных   цепей,   связанных   дисульфидными
мостиками (Vunnar, Fohansson,  1969,  Spiegelberg,  1977,  Ruddick,  Leslie,
1977). Роль в организме человека  почти  не  изучена.  Полагают,  что  он  -
секреторный иммуноглобулин. Сывороточный IgD обнаружен только у  человека  и
приматов. При электрофорезе в агаровом геле  подвижность  IgD  соответствует
подвижностям  (  и  (  глобулинов.   Точных   экспериментальных   данных   о
присутствии IgD у животных пока не имеется.
    д) Иммуноглобулины класса Е.  IgE впервые идентифицирован  K.  Ishisaka,
F. Fshisaka (1966). Молекулярная масса IgЕ 190 000,  константы  седиментации
8  S.  Молекула  IgE  также  состоит  из   двух  легких   и   двух   тяжелых
полипептидных  цепей,   молекулярная  масса  которых  22  600   и   72   500
соответственно.  Содержание  углеводов свыше 12% (Шаханина,  Стоев,   1981).
IgE играют важную роль в патогенезе  аллергии   (Isgizaka,  Ishizaka,  1976,
Dorrington, Bennich, 1978).  К.Г.Стоев (1979) разработал методы выделения  и
количественного  определения  D  и  Е  иммуноглобулинов  в  сыворотке  крови
здоровых и больных людей.

                  ПРЕПАРАТИВНОЕ ВЫДЕЛЕНИЕ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
    Для выделения  иммуноглобулинов из сыворотки  крови  животных,  особенно
G1, М и А, применяют различные  методы  получения  предварительно  очищенных
белков,   обогащенных   соответствующими   иммуноглобулинами.     Дальнейшую
очистку проводят ионообменной хроматографией на ДЭАЭ- сефадексе А-50,  ДЭАЭ-
целлюлозе  ДЕ-52,  гель-фильтрацией  на  сефедексе  G-200  или   препаратным
электрофорезом.

                   ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО  ОЧИЩЕННЫХ
                         ПРЕПАРАТОВ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ
    С  этой  целью  обычно  применяют  методы   предварительного   выделения
иммуноглобулинов.

                  ОСАЖДЕНИЕ 4 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА АММОНИЯ
    4 М раствором сульфата аммония осаждаются все белки  сыворотки,  включая
альбумин.
    В этой фракции, содержится основная масса иммуноглобулинов  G1  и  G2  и
значительное количество IgМ и IgА ,  хотя последние обычно обнаруживаются  и
в надсадочной жидкости.  Поэтому  осадок, полученный 4 М раствором  сульфата
аммония,    может   служить   источником    приготовления    всех    классов
иммуноглобулинов, что имеет большое значение, особенно для выделения  их  из
одной пробы сыворотки.
                     ОСАЖДЕНИЕ 2,78 М РАСТВОРОМ АММОНИЯ
    К холодной сыворотке крови добавляют  равный  объем   холодного  2,78  М
раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С 2  ч.  Сладок  растворяют  в
изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При  этом  2,78
М раствором сульфата аммония в основном  осаждаются  иммуноглобулины  класса
G. Причем   , такая концентрация соли осаждает IgG2 и  ,  что  очень  важно,
наиболее  полно  IgG1  при  минимальном  осаждении  фракций   (-   и      (-
глобулинов.   Поэтому   данный   метод   наиболее   удобен   для   выделения
иммуноглобулинов G1 и G2 как из  сыворотки  крови  лошадей,  так  и  овец  и
крупного рогатого скота.
                     ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА
                            АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА
    Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке  помещают  в
1,39 М раствор  сульфата  аммония,  перемешивают  в  холодильнике  магнитной
мешалкой  2  суток  при  трехкратной  смене  раствора  соли.  Осадок  дважды
промывают 1,39 М раствором аммония.
    При этом из сыворотки крови овцы и крупного  рогатого  скота  осаждаются
иммуноглобулины G1 и  G2,  однако  иммуноглобулин  G1,  (-  и  (-  глобулины
присутствуют лишь  в  следовых  количествах.  Из  сыворотки  крови  лошадей,
главным образом выделяется иммуноглобулин G2,  IgG(Т)  присутствует  лишь  в
небольшом количестве.
    Таким образом, препарат получаемый 1,39  М  раствором  сульфата  аммония
путем диализа удобен для выделения IgG2 из сыворотки крови овец  и  крупного
рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается  из  сыворотки  крови
лошадей.
                         ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ
    К охлажденной сыворотке крови  по  каплям  добавляют   холодный  2,53  М
раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1  М.  Перемешивают
2 час в холодильнике,  осадок  растворяют  и  диализируют.   1  М  раствором
сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и  G2,  практически  свободные
от  фракции  (-глобулинов. По  нашим данным,  этот метод достаточно прост  и
выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2  из  сыворотки крови  овец  и
крупного рогатого скота.  Недостаток метода в том,  что  такая  концентрация
соли не обеспечивает  полного  осаждения  иммуноглобулина  G1.  По  составу,
препарат,  выделяемый сульфатом  натрия,  идентичен  препарату,  получаемому
1,39 М раствором   сульфатом  аммония,  поэтому  он  наиболее  пригоден  для
выполнения иммуноглобулина G2.

                  ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50
    Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50
типа средний (100-200 меш). Предварительную  обработку  и  регенерацию  ДЭАЭ
-сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным  буфером,
рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с  незначительными  изменениями
(Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).
    Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле,   где в зоне  (
-глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные (  -глобулиновые  фракции
- IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, -  три  линии  преципитации  -  IgG1,
IgG2 и IgM. Таким образом,  применив  метод  J.Baumstark  et  al  (1964)  не
получили чистые фракции IgG1 и IgG2  из  сыворотки  крови  овец  и  крупного
рогатого скота, а только их смесь.
    Следует по
1234
скачать работу

Методы разделения иммуноглобулинов

 

Отправка СМС бесплатно

На правах рекламы


ZERO.kz
 
Модератор сайта RESURS.KZ