Главная    Почта    Новости    Каталог    Одноклассники    Погода    Работа    Игры     Рефераты     Карты
  
по Казнету new!
по каталогу
в рефератах

Адам туберкулезінің серологиялық балауында моноклоналды антиденелерді колдана отырып ИФТ және ИФР әдістерін кою



 Другие рефераты
БАЛДЫРЛАР ОРТАСЫНДАОРГАНИКАЛЬІҚ ЕРИТІН ЗАТТАРДЫҢ ТОПТАЛУЫ БАЛЛЫРЛАР ОРТАСЫНЫҢ ӨСУ ЕРЕКШЕЛІКТЕРІ Mycobacterium tuberculosis ультрадыбысты дезинтеграты мен липополисахаридті антигенінің моноклоналды антиденелерді өндіретін гибридті жасушалар штамдарын алу Туберкулез антигенін алу және олардың сипаттамасы

Осы зерттеудің максаты адамдар қан сарысуындағы туберкулезге қарсы антиденелерді анықтау үшін ИФТ «жанама» және «бәсекелі» қойылымдарын ИФР-ын жүргізу шарттары мен техникасын жетілдіру болып табылады. Осыған байланысгы біз Мусоbacterium tuberculosis-тың ақуызды антигеніне антиденені табу үшін ИФТ-дың сезімталдығына физико-химиялык факторлардың (температура, иондык күш және реакциялык ортаның рН маңызы, өзара байланысу ұзактығы, концентрациялық катынасы) әсерін зерттедік.

Туберкулез микобактерияларына телімді антиденелерді ИФТ «жанама» қойылымымен анықтау сызбасы негізгі 5 кезеңнен тұрады:

1 – ші кезеңде -антиген катты фазага адсорбцияланады.

2 – ші кезеңде — зерттеуге алынған материал кұрамындағы антиденелер катты фазаға адсорбцияланған антигенмен спецификалық байланысады да «антиген+антидене» иммунды кешенін кұрайды.

3-ші кезең — ферментпен танбаланған антиденелер (конъюгат) «антиген+ антидене» кешенімен телімді байланысып, «антиген+антидене+конъюгат» иммунды кешеніні пайда болады.

4-ші кезең — субстрат ерітіндісінің көмегімен «антиген+антидене+ конъюгат» иммунды кешенін анықтау. Бұл кезенде, реакция нәтижесі оң болған жағдайда субстрат сұйықтығының түсінің өзгеруі байқалады.

5-ші кезең — реакция нәтижесін немесе ферменттік реакция өнімдерінің оптикалық тығыздығын спектрофотометрдің көмегі арқылы бағалау.

ИФТ-дың «бәсекелі» койылымында антиген қатты фазаға адсорбцияланған моноклоналды антиденелермен байланысып реакция кезеңі бір сатыға артады.

Әрбір кезеңнің оңтайлы параметрлерін анықтау үшін ИФТ-ды бес рет қайталап жүргіздік.

Зерттеу нәтижелері бойынша ИФТ-дың жеткілікті сезімталдығын камтамасыз ететін Мусоbacterium tuberculosis-тің ақуызды антигенінің оңтайлы концентрациясы 5-10 мкг/мл-ді көрсетті. Антигендердің концентрациясын әрі қарай жоғарылату реакцияның телімсіз боялуының артуы мен препараттарды ұтымсыз жұмсауға алып келді. Алынған нәтижелерді талдау барысында колданылған барлық ақуызды антигендердің ИФТ-ға қажетті қатты фазада жақсы сорбцияланатындыгын дәлелдейді.

Біз иммунды ферментті талдауда бірінші антидене мен антиген ретінде қолданылатын Мусоbасtеrіит tuberculosis-тің ақуызды антигеніне телімді моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау үшін бірқатар тәжірибе жүргіздік. Моноклоналды антиденелердің оңтайлы концентрациясын анықтау барысында моноклоналды антиденелердің концентрациясы 10 мкг/мл болған жағдайда полистиролды планшет шұңқыршықтарының белсенді орталыктарының толық инактивацияланатындығы айкындалды. Моноклоналды антиденелердің анағұрлым жоғары концентрациясын колдану препараттарды орынсыз жұмсалуына әкеліп соқтырды. Моноклоналды антиденелерді катты фазамен толық байланыстыру үрдісі 37°С температурада 1 сағатта аяқталды. Сонымен катар, сенсибилизацияны 4°С температурада 16 сағат бойы жүргізген жағдайда да жаксы нәтижелерге кол жеткіздік. Түрлі буферлі ерітінділердің рН-ның мәнін МКА қатты фаза беткейінде адсорбциялануына, «МКА+антиген+телімді антидене+конъюгат» кешенінің пайда болу реакциясына әсері түрлі иондық күш (2,0-ден 10,0-ға дейінгі) диапазоны зерттелінді. Буферлік жүйе ретінде зерттеуге рН 2.0 жэне 4,0 болатын натрий-ацетатты ерітіндісі, рН 7,0 және 7,4 болатын буферленген физиологиялық ерітінді, рН 9,5 және 10,0 болатын натрий-карбонатты буфері алынды. Тәжірибелер нәтижелері бойынша, ИФТ-да реакциялық сұйықтықтың боялу карқындылығы буферлі ерітінділердің рН мәніне тікелей тәуелді, яғни олардың рН-ы 7,0-10,0 аралығында болған жағдайда жоғары көрсеткіштерге қол жеткіздік. ИФТ қоюда антиген мен зерттелетін антидене арасындағы, сонымен қатар «антиген-антидене» иммунды кешені мен иммунды пероксидазалы конъюгат арасындағы тепе-тендік айтарлыкқтай маңызды орын алатындығы белгілі. Катты фаза беткейіне адсорбцияланған антиген мен МКА байланысу кинетикасын бағалау +37°С температурада 30 минут, 1, 2, 3 және 4 сағат аралығында жүрг ізілді.

Антиген-антидене реакциясындағы тепе-теңдік 2 сағат инкубацияланғаннан кейін пайда болып, оларды оптикалык тығыздығы 0,980- 1.044 о.б. кұрады. Экстинцияның жоғарылауы катты фаза беткейімен ақуыздың телімсіз байланысуының арқасында «фондық» көрсеткіштің 20-40% артуына алып келді.

Түрге қарсы пероксидазалық конъюгат пен антиген+антидене кешенінін байланысын бағалау нәтижесінде жүйелер арасындағы тепе-теңдік +37°С температурада 1 сағат бойы инкубациялау барысында байқалды. Ал, реакциялык сұйыктықтың оптикалық тығыздығы 0,930-0,950 о.б. шамасында ауытқып отырды. Негативті бақылау сарысуын қолданған жағдайда бұл көрсеткіш 0,370-0,390 о.б. шамасында болды. 1 сағаттан артық инкубациялау бақылауга койылған сынаманың оптикалық тығыздық шамасының 30-35%-ға артып «фондық» боялудың өсуіне алып келді.

Біз антитүрлік конъюгаттардың (флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) «Сигма» шығарған (ФРГ) «антиген-антидене» кешенімен байланысу кинетикасына әсер ету ұзақтығы мен тәртібін зерттедік (8-кесте).

 

Кесте 8 — ФИТЦ-пен МКА-ді конъюгациялау шарттары

Клон атауы

МКА 1 мг-ғы ФИТЦ мөлшері

5 – 10 мкг

20 – 25 мкг

30 – 40 мкг

40 – 45 мкг

1Д7

Өте әлсіз жарқырау

Әлсіз жарқырау

Біркелкі жарқырау

Телімсіз жарқырау

2С10

Өте әлсіз жарқырау

Әлсіз жарқырау

Біркелкі жарқырау

Телімсіз жарқырау

1G3

Өте әлсіз жарқырау

Әлсіз жарқырау

Біркелкі жарқырау

Телімсіз жарқырау

 

Кестеден көргеніміздей 1 мг МКА-де ФИТЦ-тің анағұрлым үйлесімді мөлшері 30-40 мкг кұрады. Экспозициянын жоғарылауы ФИТЦ бояғышы коспаларының болуына байланысты «фондық» көрсеткішінің 40-60%-ғы артатындығы байкалды.

Иммунды флюоресцентті конъюгатты қолдану барысында телімсіз байланысудың (боялу) анағұрлым төмен дәрежесі мен флюоресценция максималды жұмыс сұйылтымы 1:50-ге жетті.

Иммунды флюоресцентті реакциясының тікелей әдісін қажетті жағынды микобактериядан заттық шынысының бетінде дайындалды.

Туберкулезге шалдыққан науқастардан алынған биологиялық материалдың барлығы 10 сынамасы «бэсекелі» ИФТ және ИФР әдістерімен зерттелді. Бакылау ретінде Циль-Нильсен әдісімен боялған жағындылар микроскопиясы мен тығыз қоректік орталарда өсірілген Мусоbacterium tuberculosis культурасы анықталды (9-кесте).

 

Кесте 9 — Туберкулезге алынған сынамаларды зерттеу нәтижелері

Сынамалар

Зерттеу әдістері

  Бактериоскопия Бактериология ИФР “бәсекелі” ИФТ

1

+

+

+

+

2

+

+

yandex_partner_id = 17941; yandex_site_bg_color = 'FFFFFF'; yandex_stat_id = 1214626; yandex_site_charset = 'utf-8'; yandex_ad_format = 'direct'; yandex_font_size = 1; yandex_font_family = 'tahoma'; yandex_direct_type = 'horizontal'; yandex_direct_border_type = 'ad'; yandex_direct_limit = 3; yandex_direct_title_font_size = 2; yandex_direct_header_bg_color = 'FEEAC7'; yandex_direct_bg_color = 'FFF9F0'; yandex_direct_border_color = 'FBE5C0'; yandex_direct_title_color = '0000CC'; yandex_direct_url_color = '006600'; yandex_direct_all_color = '0000CC'; yandex_direct_text_color = '000000'; yandex_direct_hover_color = '0066FF'; yandex_direct_favicon = true; document.write('');


 

Отправка СМС бесплатно

На правах рекламы


     ZERO.kz          
 
Модератор сайта RESURS.KZ